Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11925:2017 về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Phụ lục B

(tham khảo)

Phương pháp tách chiết ADN từ vi khuẩn Gram âm

B.1  Khả năng áp dụng

Phương pháp này thích hợp để tách chiết ADN từ vi khuẩn Gram âm bằng phân giải hoặc đun sôi.

B.2  Tình trạng

Phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi^[1]. Ngoài ra, phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong một nghiên cứu cộng tác để phát hiện các chủng Salmonella trong các mẫu canh thang tăng sinh từ sữa bột ^{[2], [3]} và trong một nghiên cứu cộng tác để phát hiện Escherichia coli sinh verotoxin (VTEC) trong thịt xay ^{[4], [5]}.

B.3  Nguyên tắc

...

...

...

Nguyên liệu khởi đầu thường là canh thang đã được tăng sinh.

B.4  Thuốc thử

B.4.1  Dung dịch đệm rửa, nước muối sinh lý [ρ(NaCl) = 9 g/l] hoặc nước muối đệm phosphat (PBS) ρ(NaCl) = 8 g/l, ρ(KCl) = 0,2 g/l, ρ(Na₂HPO₄) = 1,44 g/l, ρ(KH₂HPO₄) = 0,24 g/l; pH 7,4].

B.5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

B.5.1  Microlit pipet.

B.5.2  Máy ly tâm Bench-top, dùng cho các bình phản ứng microlit, có dung tích từ 1,5 ml đến 2 ml và có thể chỉnh gia tốc ly tâm đến 10 000 g.

B.5.3  Nồi cách thủy hoặc khối nhiệt, dùng cho bình phản ứng microlit, có khả năng làm nóng đến 100 °C.

B.5.4  Máy khuấy trộn, ví dụ: máy trộn vortex.

...

...

...

B.6.1  Yêu cầu chung

Sau khi tăng sinh, ADN của vi khuẩn được tách chiết theo B.6.2,

B.6.2  Quy trình tách chiết

Chuyển 1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn vào ống phản ứng. Ly tâm huyền phù tế bào trong 10 min ở gia tốc 10 000 g (B.5.2). Gạn phần nổi phía trên.

Hòa lại phần cặn trong 1 ml dung dịch đệm rửa (B.4.1) hoặc nước. Ly tâm huyền phù tế bào trong 10 min ở gia tốc 10 000 g (B.5.2). Gạn phần nổi phía trên.

Hòa lại phần cặn trong khoảng từ 200 µl đến 250 µl nước. Thực hiện việc phân hủy tế bào nhiệt bằng cách gia nhiệt trong 20 min ở 95 °C (Salmonella) hoặc 15 min ở 100 °C (STEC).

Chuyển các bình phản ứng sang bể đá lạnh để làm nguội nhanh.

Trộn mạnh dịch phân giải [ví dụ: sử dụng máy khuấy trộn (B.5.4)]. Ly tâm ở nhiệt độ từ 20 °C đến 25 °C trong 3 min ở gia tốc 10 000 g (Salmonella) hoặc 10 s ở gia tốc 10 000 g (STEC).

Chuyển phần nổi phía trên sang bình phản ứng microlit mới.

...

...

...

Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất, có thể sử dụng các hệ thống tách chiết và tinh sạch có sẵn trên thị trường thay cho việc phân giải tế bào nhiệt và tinh sạch cần thiết.

B.7  Đánh giá xác nhận

Phương pháp này đã được sử dụng rộng rãi và là phương pháp cơ bản trong sinh học phân tử. Ngoài ra, phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong các thử nghiệm cộng tác.

Năm 1998, một thử nghiệm liên phòng được DIN (Viện Tiêu chuẩn Đức) tổ chức nhóm làm việc "PCR để phát hiện các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm". Mười hai phòng thí nghiệm đã tham gia vào thử nghiệm này, mỗi phòng thử nghiệm nhận được 20 mẫu. Mẫu là sữa bột ít chất béo. Một phần của sữa bột này đã được gây nhiễm nhân tạo với mức 1 000 cfu Salmonella/25 g. Trong các phòng thí nghiệm các mẫu đã được chuẩn bị như sau đây trước khi tách chiết ADN: 25 g mẫu được cho vào 250 ml chất lỏng tăng sinh không chọn lọc (xanh brilliant 0,002 %) và ủ ở 37 °C trong 16 h. Việc tách chiết axit nucleic bắt đầu với 1 ml canh thang mẫu đã tăng sinh này. Các dịch chiết đã được thử nghiệm bằng PCR. Tổng số có 240 mẫu được phân tích; 1 mẫu đã được tìm thấy là âm tính giả và 2 mẫu dương tính giả; 14 mẫu ức chế PCR đã được quan sát.

Năm 2001, phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong một nghiên cứu cộng tác của nhóm làm việc "PCR để phát hiện các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm" của Viện nghiên cứu Liên Bang Đức bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và thuốc thú y (BgVV) theo Điều 35 của Luật thực phẩm - Liên bang Đức. Mười một phòng thử nghiệm đã tham gia. Mỗi phòng nhận được mười mẫu thịt xay được chuẩn bị từ hai nền mẫu cơ bản. Trong mỗi trường hợp, năm trong số các mẫu bị nhiễm đồng đều về các chủng STEC/EHEC với các mức nhiễm 54 cfu/25 g và 308 cfu/25 g thịt xay. Hệ sinh vật kèm theo với mức nhiễm từ 10⁵ cfu/g đến 10⁶ cfu/g và đôi khi cao hơn (do kết quả của việc vận chuyển). Các mẫu từ 1 đến 9 (được chuẩn bị từ vật liệu cơ bản) là các mẫu bị nhiễm tự nhiên với 4 chủng STEC. Tỷ lệ phát hiện PCR đối với tất cả các phòng thử nghiệm là 100 %.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F., MANIATIS, T. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987 (ISBN 0-87969-309-6)

[2] SCHEU, P., GASCH, A., ZSCHALER, R., BERGHOF, K. and WILBORN, F. Evaluation of a PCR-ELISA for food testing: Detection of selected Salmonella serovars in confectionery products. Food Biotechnology, 12 (1&2), 1998, pp. 1-12

...

...

...

[4] G ALLIEN, P., RICHTER, H., MUCH, Chr., FRÖBE, I., PERLBERG, K.-W. and PROTZ, D. Optimierung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis und zur Charakterisierung von Shigatoxin-produzierenden Escherichia coli (STEC). Lebensmitteln. Beri. Münch. Tierärztl. Wschr. 110, 1997, p. 422

[5] Detection, isolation and characterization of verotoxin-forming Escherichia coli (VTEC) in minced meat by means of PCR and DNA hybridization. No. L 07.18-1 in: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal health Office, loose leaf edition, Beuth Verlag GmbH

[6] TCVN 4829 (ISO 6579), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch.

[7] TCVN 4830-3 (ISO 6888-3), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (Staphylococcus aureus và các loài khác) trên đĩa thạch - Phần 3: Phát hiện và dùng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (MPN) để đếm số lượng nhỏ.

[8] TCVN 4992 (ISO 7932), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 độ C.

[9] TCVN 4991 (ISO 7937), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Clostridium perfringens trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc.

[10] TCVN 7715-1 (ISO 10272-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Campylobacter spp. - Phần 1: Phương pháp phát hiện.

[11] TCVN 8127 (ISO 10273), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phát hiện Yersinia enterocolitica gây bệnh giả định.

[12] TCVN 7700-1 (ISO 11290-1, With Amd. 1:2004), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes - Phần 1: Phương pháp phát hiện.

...

...

...

[14] TCVN 11131 (ISO/TS 20836), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Phép thử hiệu năng đối với máy chu trình nhiệt.

[15] TCVN 7682 (ISO 20838), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp định tính.

[16] TCVN 8131 (ISO 21567) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Shigella spp.