TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14235:2024

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH GLUTEN THỦY PHÂN TỪNG PHẦN TRONG SẢN PHẨM LÊN MEN CÓ NGUỒN GỐC TỪ NGŨ CỐC VÀ ĐẬU ĐỖ - PHƯƠNG PHÁP ELISA CẠNH TRANH R5

Foodstuffs - Determination of partially hydrolyzed gluten in fermented cereal-based and pulse-based products - R5 Competitive ELISA method

Lời nói đầu

TCVN 14235:2024 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2015.05 Partially hydrolyzed gluten in fermented cereal-based products. R5 Competitive ELISA;

TCVN 14235:2024 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F1 Ngũ cốc và đậu đỗ biên soạn, Viện Tiêu chuẩn Chất lượng Việt Nam đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH GLUTEN THỦY PHÂN TỪNG PHẦN TRONG SẢN PHẨM LÊN MEN CÓ NGUỒN GỐC TỪ NGŨ CỐC VÀ ĐẬU ĐỖ - PHƯƠNG PHÁP ELISA CẠNH TRANH R5

...

...

...

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định gluten thủy phân từng phần trong các sản phẩm thực phẩm lên men có nguồn gốc từ ngũ cốc và đậu đỗ.

Phương pháp này đã được xác nhận giá trị sử dụng trên các nền mẫu: bia, xyrô tinh bột, tinh bột, dịch chiết malt, bột nhào lên men và nước tương (xem Phụ lục A).

Tiêu chuẩn này không áp dụng để xác định gluten chưa thủy phân.

2  Tài liệu viện dẫn

Tiêu chuẩn này không sử dụng tài liệu viện dẫn.

3  Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên phản ứng miễn dịch enzym sử dụng kháng thể đơn dòng. Kháng thể này liên kết với trình tự axit amin ngắn QQPFP (glutamin-glutamin-prolin-phenylalanin-prolin) và với các trình tự liên quan, tồn tại dưới dạng motip trên tất cả các tiểu đơn vị prolamin ^[6]. Một số trình tự có khả năng kích thích miễn dịch celiac ^{[7], [8]}. Các hợp phần protein để xác định gluten từ thực phẩm được chiết bằng etanol. Sau khi ly tâm, phần nổi phía trên được sử dụng trong phép thử ELISA.

CHÚ THÍCH: Không quan sát thấy có phản ứng chéo đối với yến mạch, ngô, gạo, kê, teff, kiều mạch, quinoa hoặc hạt dền amranth.

...

...

...

4  Thuốc thử và vật liệu thử

Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích, nước sử dụng là nước cất hai lần hoặc nước có chất lượng tương đương.

Tất cả thuốc thử có thể bền được ít nhất 15 tháng khi bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

4.1  Khay vi thể (microtiter) (96 giếng), được tráng gliadin1).

4.2  Chất chuẩn

Lúa mì, lúa mạch đen và đại mạch được thủy phân riêng biệt bằng pepsin và trypsin, các hợp phần peptit được trộn lẫn (để chuẩn bị dung dịch chuẩn) và hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Dumas^[1],[5]. Chất chuẩn được bảo quản ở -20 °C ở dạng đông khô cho đến khi hoàn nguyên. Hoàn nguyên chất chuẩn trong dung dịch etanol 60 % (4.14) sao cho thu được nồng độ prolamin là 1 mg/ml. Các chất chuẩn pha sẵn trong bộ thử nghiệm ổn định trong tối thiểu 18 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8°C.

CHÚ THÍCH: Do bản chất của chất chuẩn, tất cả các kết quả chỉ có thể truy xuất liên kết chuẩn đến điểm mốc tương đối này. Không thể xác định độ đúng nếu sử dụng chất chuẩn không phải là chất chuẩn được chứng nhận. Do đó, độ chính xác của hệ thống thử nghiệm có thể bị sai lệch nhưng vẫn chấp nhận được.

4.3  Các dung dịch chuẩn, được chuẩn bị từ chất chuẩn (4.2), có các nồng độ gluten tương ứng 0, 20, 60, 180 và 540 ng/ml, đã pha sẵn để sử dụng, đựng trong chai có nắp đậy trong suốt, thể tích dung dịch là 1.3 ml ¹⁾.

4.4  Dung dịch chuẩn để bổ sung vào mẫu thử

...

...

...

Dung dịch bền trong 4 tuần khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

4.5  Chất cộng hợp, kháng thể peroxidase từ cải ngựa ký hiệu là R5; 0,7 ml, độ đậm đặc 11 lần, đựng trong chai màu đỏ có nắp ¹⁾.

4.6  Dung dịch cộng hợp

Hoàn nguyên chất cộng hợp (4.5) bằng cách pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:10 (ví dụ: 100 μl chất cộng hợp đậm đặc và 1 ml nước, đủ cho hai khay vi thể (4.1)). Trước khi lấy bằng pipet, lắc kỹ chai đựng dung dịch chất cô đặc cộng hợp. Cần đảm bảo nước sử dụng không bị nhiễm gliadin.

Dung dịch cộng hợp enzym đã pha loãng có độ ổn định hạn chế, do vậy chỉ hoàn nguyên lượng cần thiết cho phép phân tích tiếp theo trong ngày sử dụng.

4.7  Thuốc nhuộm đỏ (Red Chromogen Pro.), 10 ml, pha sẵn để sử dụng, đựng trong chai màu nâu có nắp ¹⁾.

4.8  Dung dịch dừng phản ứng, 14 ml, pha sẵn để sử dụng, đựng trong chai màu vàng có nắp¹⁾.

CẢNH BÁO: Dung dịch dừng phản ứng có chứa axit sulfuric 0,5 M. Không để dung dịch này tiếp xúc với da và mắt.

4.9  Dịch pha loãng mẫu đậm đặc, 60 ml, độ đậm đặc 5 lần, đựng trong chai màu trắng có nắp¹⁾.

...

...

...

Pha loãng một lượng nhất định dịch pha loãng mẫu đậm đặc (4.9) bằng nước (ví dụ: 3 ml dịch pha loãng mẫu đậm đặc và 12 ml nước, đủ để pha loãng 10 mẫu). Dịch pha loãng mẫu này bền trong 1 ngày, cần đảm bảo rằng dịch pha loãng mẫu không bị nhiễm gliadin.

4.11  Chất đệm rửa, 100 ml, dạng cô đặc gấp 10 lần, đựng trong chai màu nâu có nắp ¹⁾.

4.12  Dung dịch đệm rửa

Pha loãng một lượng nhất định chất đệm rửa (4.11) bằng nước (ví dụ: 100 ml chất đệm rửa và 900 ml nước). Nếu chất đệm rửa có chứa tinh thể thì hòa tan các tinh thể bằng cách đun vật chứa trong nồi cách thủy ở 37 °C.

Dung dịch đệm rửa này bền trong 4 tuần khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

4.13  Etanol, 99 %.

4.14  Etanol 60 %

Cho 150 ml etanol (4.13) vào 100 ml nước cất và lắc đều.

4.15  Gelatin cá 2).

...

...

...

Cho 30 ml nước vào xyranh chia vạch 100 ml, thêm 10 g gelatin cá (4.15) và trộn kỹ, thêm 60 ml etanol (4.13), trộn và chỉnh pH đến 8,5 nếu cần. Thêm nước đến 100 ml.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và thiết bị, dụng cụ cụ thể như sau:

5.1  Máy xay/máy nghiền, cối và chày phòng thử nghiệm.

5.2  Máy quay hoặc máy lắc.

5.3  Máy ly tâm.

5.4  Bộ đọc khay vi thể.

5.5  Micropipet, có thể phân phối các thể tích từ 20 μl đến 200 μl và 200 μl đến 1000 μl.

5.6  Pipet chia vạch.

...

...

...

5.8  Lọ thủy tinh ly tâm, có nắp vặn.

5.9  Máy trộn Vortex.

5.10  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 mg.

5.11  Máy đo quang phổ, có thể đo ở bước sóng 450 nm.

6  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 9027 (ISO 24333)^[2].

Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Bảo quản mẫu trong phòng khô, lạnh, tránh ánh sáng.

7  Chuẩn bị mẫu thử

...

...

...

a) Tiến hành chuẩn bị mẫu trong phòng cách ly với quy trình ELISA (xem 8.2); nếu chỉ có một phòng, cần xem xét độ nhạy cao của phép thử vả kiểm tra mức độ ô nhiễm.

b) Bụi ngũ cốc trong không khí và thiết bị phòng thử nghiệm đã qua sử dụng có thể làm ô nhiễm gliadin trong phép thử. Do đó, cần đeo găng tay trước khi bắt đầu thử nghiệm và trong quá trình thử nghiệm.

c) Làm sạch các bề mặt tiếp xúc, lọ thủy tinh, máy xay và các thiết bị khác bằng etanol 60 % (4.14), trước khi sử dụng cho mẫu tiếp theo.

d) Kiểm tra ô nhiễm gliadin của thuốc thử và thiết bị bằng que thử, nếu cần.

e) Mẫu dạng rắn có thể không đồng nhất; do đó, nghiền thật kỹ phần mẫu đại diện và đồng nhất trước khi cân.

7.2  Đồng hóa phần mẫu thử

7.2.1  Mẫu dạng rắn (ví dụ: tinh bột)

Cân 1 g phần mẫu thử, đồng hóa bằng máy lắc (5.2) và thêm 10 ml dung dịch etanol 60 % (4.14).

7.2.2  Mẫu dạng lỏng (ví dụ: xyrô tinh bột)

...

...

...

7.2.3  Mẫu bia

Dùng pipet chia vạch (5.6), lấy 1 ml phần mẫu thử, thêm 9 ml dung dịch etanol 60 % có chứa gelatin cá (4.16) và trộn. Khuấy huyền phù trước và trong khi sử dụng.

7.2.4  Mẫu malt và hoa hublong

Cân 1 g phần mẫu thử, thêm 10 ml dung dịch etanol 60 % có chứa gelatin cá (4.16) và trộn. Khuấy huyền phù trước và trong khi sử dụng.

7.3  Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Trộn kỹ phần mẫu thử [đã đồng hóa (xem 7.2), nếu cần] trong ít nhất 30 s bằng máy trộn Vortex (5.9) và lắc kỹ bằng cách đặt ngược vật chứa trên máy lắc (5.4) hoặc dùng máy quay (5.4) trong 10 min. Ly tâm phần mẫu thử với gia tốc ít nhất là 2500 g, ở nhiệt độ phòng (từ 20 °C đến 25 °C) trong 10 min. Tách riêng phần nổi phía trên, pha loãng 50 lần bằng dịch pha loãng mẫu (4.10), ví dụ: trộn 20 μl phần nổi phía trên sau khi ly tâm với 980 μl dịch pha loãng mẫu.

Phần nổi phía trên thu được sau khi ly tâm có thể bền trong bốn tuần khi được bảo quản trong lọ đậy kín, để nơi tối ở nhiệt độ phòng.

Sử dụng 50 μl dung dịch mẫu thử cho mỗi giếng trong phép thử (xem 8.2).

8  Cách tiến hành

...

...

...

a) Phép thử này chỉ được thực hiện bởi nhân viên phòng thử nghiệm được đào tạo. Phải tuân thủ nghiêm ngặt hướng dẫn sử dụng. Không tráo đổi thuốc thử riêng lẻ giữa các bộ thử nghiệm có số lô khác nhau.

b) Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. Chất sinh màu đỏ nhạy với ánh sáng do đó tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng.

c) Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C ngay sau khi sử dụng. Các vi giếng chưa sử dụng phải được đưa trở lại túi giấy bạc ban đầu. Làm kín miệng túi, giữ lại chất hút ẩm có sẵn bên trong túi.

d) Không để các vi giếng bị khô giữa các bước thao tác.

e) Độ tái lập trong phép thử ELISA phụ thuộc nhiều vào độ nhất quán khi rửa các vi giếng, cẩn thận làm theo trình tự rửa nêu trong quy trình của phép thử ELISA.

f) Để tránh ánh nắng trực tiếp trong suốt quá trình ủ, nên che kín các khay vi thể.

g) Phản ứng của chất sinh màu đỏ cần được thực hiện nơi tối.

h) Phân tích lặp lại hai lần đối với từng dung dịch chuẩn và từng phần mẫu thử.

i) Sử dụng mẫu không chứa gluten và mẫu bổ sung gluten làm mẫu kiểm soát phép thử.

...

...

...

a) Chèn đủ số lượng giếng vào giá đỡ vi giếng để tất cả các chất chuẩn và mẫu thử được phân tích lặp lại hai lần. Ghi lại các vị trí của chất chuẩn và mẫu thử.

b) Dùng micropipet (5.5) thêm 50 μl mỗi dung dịch chuẩn (4.3) hoặc các dung dịch mẫu thử đã chuẩn bị (7.3), để tách riêng các giếng trong hai lần lặp lại.

c) Thêm 50 μl dung dịch cộng hợp (4.6), trộn nhẹ bằng cách lắc giếng bằng tay và ủ trong 30 min ở nhiệt độ phòng.

d) Đổ chất lỏng ra khỏi giếng và gõ mạnh giá đỡ vi giếng lộn ngược (ba lần trong một hàng) vào giấy thấm để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn chất lỏng khỏi giếng. Đổ đầy tất cả các giếng với 250 μl dung dịch đệm rửa (4.12) và đổ chất lỏng ra. Lặp lại thêm hai lần.

e) Thêm 100 μl thuốc nhuộm đỏ (4.7) vào mỗi giếng. Trộn nhẹ bằng cách lắc giếng bằng tay và ủ trong 10 min ở nhiệt độ phòng, nơi tối.

f) Thêm 100 μl dung dịch dừng phản ứng (4.8) vào mỗi giếng. Trộn nhẹ bằng cách lắc giếng bằng tay và đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm so với mẫu trắng. Đọc số đo độ hấp thụ trong vòng 10 min sau khi thêm dung dịch dừng phản ứng.

8.3  Tiêu chí xác định đường chuẩn

Hình dạng của đường chuẩn được thể hiện trong giấy chứng nhận đảm bảo chất lượng kèm theo bộ thử nghiệm. Độ hấp thụ có thể khác nhau giữa các lần chạy khác nhau (ví dụ: do nhiệt độ hoặc nhà phân tích khác nhau). Tuy nhiên, hình dạng của đường chuẩn phải giống với hình dạng được đưa ra trong giấy chứng nhận đảm bảo chất lượng.

Yêu cầu tối thiểu như sau:

...

...

...

- Giá trị OD của chất chuẩn phải liên tục giảm với nồng độ gluten cao hơn, đặc biệt khi so sánh dung dịch chuẩn 1 (0 ng/ml) và dung dịch chuẩn 2 (20 ng/ml).

Giá trị OD với dung dịch chuẩn 1 cao hơn nhiều so với giá trị OD được nêu trong giấy chứng nhận có thể là dấu hiệu của lỗi trong quá trình dùng pipet hút các dịch lỏng hoặc do quá trình ủ.

9  Tính và biểu thị kết quả

Tính kết quả bằng cách sử dụng hàm chốt trục bậc ba (cubic sμline function). Không sử dụng phép ngoại suy. Nồng độ prolamin trong dịch chiết mẫu được đọc từ đường chuẩn và được tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml).

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng phần mềm RIDA^®SOFT Win (No. 29999) 4).

Phương pháp nêu trong tiêu chuẩn này sử dụng chất chuẩn là hỗn hợp thủy phân prolamin từ lúa mì, lúa mạch đen và đại mạch (xem 4.2), do đó nồng độ prolamln trong dịch chiết mẫu được chuyển đổi thành nồng độ gluten theo hệ số chuyển đổi bằng 2.

a) Đối với mẫu dạng rắn

Hàm lượng gluten trong mẫu thử, X, biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo Công thức (1):

...

...

...

Trong đó:

c

là nồng độ gluten trong dịch chiết mẫu, tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml);

500

là hệ số pha loãng, bằng thể tích dung dịch mẫu thử thu được trên khối lượng phần mẫu thử (xem Điều 7), tính bằng mililit trên gam (ml/g);

1000

là hệ số chuyển đổi từ gam sang kilogam.

b) Đối với mẫu dạng lỏng

Hàm lượng gluten trong mẫu thử, X, biểu thị bằng miligam trên lít (mg/L), được tính theo Công thức (2):

...

...

...

(2)

Trong đó:

c

là nồng độ gluten trong dịch chiết mẫu, tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml);

500

là hệ số pha loãng, bằng thể tích dung dịch mẫu thử thu được trên thể tích phần mẫu thử (xem Điều 7);

1000

là hệ số chuyển đổi từ mililit sang lít.

Ngoài ra, có thể sử dụng đường cong đa thức bậc hai.

...

...

...

Các giá trị độ chụm dưới đây được xác định từ dữ liệu phân tích liên phòng thử nghiệm nêu trong Phụ lục A. Các giá trị độ chụm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với dải nồng độ và nền mẫu đã sử dụng.

10.1  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong cùng một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r = 2,77 s_r, giá trị s_r được nêu trong Bảng A.1 của Phụ lục A.

10.2  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giá trị giới hạn tái lập R = 2,77 s_R, giá trị s_R được nêu trong Bảng A.1 của Phụ lục A.

11  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

- mọi thông tin cần thiết cho việc nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;

...

...

...

- ngày nhận mẫu của phòng thử nghiệm;

- ngày thử nghiệm;

- mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi sự cố bất thường có thể ảnh hưởng đến các kết quả.

Phụ lục A

(tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Dữ liệu độ chụm nêu trong Bảng A.1 thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm thực hiện năm 2011 do 16 phòng thử nghiệm tham gia, tiến hành trên 7 mẫu thử theo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này. Kết quả chi tiết về nồng độ gluten xác định bởi toàn bộ 16 phòng thử nghiệm được nêu trong Bảng A.2 và nồng độ gluten xác định bởi 13 phòng thử nghiệm sau khi loại trừ các phòng thử nghiệm E, F, K được nêu trong Bảng A.3.

Bảng A.1 - Dữ liệu thống kê về độ chụm

...

...

...

Mã số mẫu

1

2

3

4

5

6

7

Tổng số phòng thử nghiệm sau khi trừ ngoại lệ

...

...

...

12

11

13

13

13

13

Tổng số lần lặp lại

26

24

...

...

...

26

26

26

26

Giá trị trung bình của tất cả dữ liệu, mg/kg

2,36

26,2

119,5

1,29

...

...

...

48,4

145,6

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/kg

2,31

7,92

37,2

2,03

1,73

11,2

...

...

...

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, mg/kg

2,98

9,67

37,2

3,05

3,65

12,5

40,0

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r, %

...

...

...

30,2

31,2

157,3

16,3

23,1

19,5

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R, %

126,1

36,8

...

...

...

236,1

34,4

25,9

27,5

Độ thu hồi, %

Không áp dụng

87

119

Không áp dụng

...

...

...

69

97

CHÚ DẪN

Các mẫu thử bao gồm:

1 Mẫu bia không chứa gluten;

2 Mẫu bia bổ sung gluten, 30 mg/kg;

3 Mẫu bia bổ sung gluten, 100 mg/kg;

4 Mẫu xyrô tinh bột không chứa gluten;

5 Mẫu xyrô tinh bột lúa mì chứa gluten tự nhiên;

...

...

...

7 Mẫu bột nhào lên men có chứa gluten, 150 mg/kg.

Bảng A.2 - Nồng độ gluten được xác định theo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này bởi tất cả các phòng thử nghiệm tham gia (dữ liệu thô)

Phòng thử nghiệm

Nồng độ gluten, mg/ kg ^a

1 ^b

2

3

4

5

...

...

...

7

Lần lặp lại

1

2

1

2

1

2

1

...

...

...

1

2

1

2

1

2

A

2,13

5,80

...

...

...

20,5

111,6

93,9

4,47

7,73

7,60

8,62

46,7

47,2

...

...

...

170,0

B

1,46

2,66

40,8

13,8

151,4

127,4

2,98

...

...

...

10,6

5,10

38,8

53,0

163,6

122,8

C

5,30

10,6

...

...

...

82,2

192,2

107,6

6,12

1,90

12,8

12,6

47,2

67,4

...

...

...

143,4

D

0,74

1,77

23,8

28,6

175,2

97,6

-3,35

...

...

...

9,80

11,0

33,0

60,2

106,4

107,6

E

6,45

20,4

...

...

...

50,4

24,6

204,0

23,5

17,6

20,4

29,4

68,6

72,8

...

...

...

244,2

F

-5,46

-3,99

14,6

27,0

124,0

160,0

-5,15

...

...

...

9h20

6,80

47,0

51,4

128,8

151,6

G

6,06

4h30

...

...

...

32,0

216,2

208,2

3,29

-2,34

15,0

14,0

46,8

85,4

...

...

...

203,0

H

7,02

1,56

44,4

26,2

145,6

32,8

5,79

...

...

...

20,5

16,1

38,8

31,0

94,6

88,9

I

-0,65

-1,33

...

...

...

13,8

101,2

64,4

-0,89

-0,62

5,44

4,22

35,8

45,0

...

...

...

75,0

J

-1,50

1,14

21,2

20,0

121,8

128,8

-0,73

...

...

...

7,40

8,00

45,6

58,3

132,9

139,2

K

16,3

14,8

...

...

...

44,8

216,7

308,6

21,1

9,70

33,5

22,4

87,5

80,0

...

...

...

30,2

L

1,69

-0,33

39,8

49,0

224,8

228,8

-1,83

...

...

...

13,2

11,6

64,0

67,2

171,6

244,6

M

-0,66

4,13

...

...

...

19,3

129,4

133,6

-2,27

-0,62

10,0

8,60

36,1

39,6

...

...

...

120,4

N

0,04

0,76

34,2

18,4

97,0

108,6

1,84

...

...

...

10,8

9h20

43,4

44,6

117,6

154,4

O

1,57

0,41

...

...

...

16,5

110,7

136,6

-0,11

1,26

11,7

8h20

51,3

46,3

...

...

...

164,6

P

5,96

0,84

25,4

24,8

149,4

111,2

1,54

...

...

...

12,6

10,8

38,2

46,2

194,8

111,2

^a Việc tính nồng độ của các mẫu chứa gluten (mẫu 2, 3, 5, 6 và 7) được thực hiện trên cơ sở hàm chốt trục bậc ba bằng phần mềm RIDA^® SOFT Win; số liệu thống kê của mẫu 1 và mẫu 4 không chứa gluten được tính trên cơ sở hàm đa thức bậc hai; các giá trị cho các mẫu mù được đưa ra dưới dạng lặp lại 1 hoặc lặp lại 2.

^b Mẫu 1, bia không chứa gluten; mẫu 2, bia bổ sung gluten 30 mg/kg; mẫu 3, bia bổ sung gluten 100 mg/kg; mẫu 4, xyrô tinh bột không chứa gluten; mẫu 5, xyrô tinh bột lúa mì chứa gluten tự nhiên; mẫu 6, bột nhào lên men có chứa gluten, 70 mg/kg; mẫu 7, bột nhào lên men cố chứa gluten, 150 mg/kg.

Bảng A.3 - Nồng độ gluten được xác định theo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này sau khi trừ ngoại lệ các phòng thử nghiệm E, F, K

...

...

...

Phòng thử nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

Lần lặp lại

...

...

...

2

1

2

1

2

1

2

1

2

...

...

...

2

1

2

A

2,13

5,80

23,6

20,5

111,6

...

...

...

4,47

7,73

7,6

8,62

46,7

47,2

153,0

170,0

B

...

...

...

2,66

40,8

13,8

151,4

127,4

2,98

2,13

10,6

5,1

...

...

...

53,0

163,6

122,8

C

5,30

10,6

34,2^c

82,2^c

192,2

...

...

...

6,12

1,90

12,8

12,6

47,2

67,4

181,4

143,4

D

...

...

...

1,77

23,8

28,6

175,2

97,6

-3,35

-3,41

9,8

11,0

...

...

...

60,2

106,4

107,6

G

6,06

4,30

32,4

32,0

216,2^d

...

...

...

3,29

-2,34

15,0

14,0

46,8

85,4

192,8

203,0

H

...

...

...

1,56

44,4

26,2

145,6

32,8

5,79

3,17

20,5

16,1

...

...

...

31,1

94,6

88,9

I

-0,65

-1,33

22,2

13,8

101,2

...

...

...

-0,89

-0,62

5,4

4,2

35,8

45,0

118,4

75,0

J

...

...

...

1,14

21,2

20,0

121,8

128,8

-0,73

-1,63

7,4

8,0

...

...

...

58,3

132,9

139,2

L

1,69

-0,33

39,8

49,0

224,8^d

...

...

...

-1,83

3,39

13,2

11,6

64,0

67,2

171,6

244,6

M

...

...

...

4,13

19,9

19,3

129,4

133,6

-2,27

-0,62

10,0

8,6

...

...

...

39,6

161,7

120,4

N

0,04

0,76

34,2

18,4

97,0

...

...

...

1,84

4,41

10,8

9,2

43,4

44,6

117,6

154,4

O

...

...

...

0,41

19,1

16,5

110,7

136,6

-0,11

1,26

11,7

8,2

...

...

...

46,3

152,8

164,6

P

5,96

0,84

25,4

24,8

149,4

...

...

...

1,54

1,33

12,6

10,8

38,2

46,2

194,8

111,2

^a Việc tính nồng độ của các mẫu chứa gluten (mẫu 2, 3, 5, 6 và 7) được thực hiện trên cơ sở hàm chốt trục bậc ba bằng phần mềm RIDA^® SOFT Win; số liệu thống kê của mẫu 1 và mẫu 4 không chứa gluten được tính trên cơ sở hàm đa thức bậc hai; các giá trị cho các mẫu mù được đưa ra dưới dạng lặp lại 1 hoặc lặp lại 2.

...

...

...

^c Trung bình ngoại lệ theo phép thử Cochran.

^d Trung bình ngoại lệ theo phép thử Grubb lặp lại.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 8133-2 (ISO/TS 16634-2), Sản phẩm thực phẩm - Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng cách đốt cháy theo nguyên tắc Dumas và tính hàm lượng protein thô - Phần 2: Ngũ cốc, đậu đỗ và sản phẩm ngũ cốc nghiền

[2] TCVN 9027 (ISO 24333), Ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc - Lấy mẫu

[3] TCVN 12438:2018 (CODEX STAN 118-1981 with Amendment 2015), Thực phẩm cho chế độ ăn đặc biệt dùng cho người không dung nạp gluten

[4] AACC International, Method 38-50.01, Immunochemical Determination of Gluten in Corn Flour and Corn-Based Products b;y Sandwich ELISA, Approved Methods of Analysis, 11th Ed., published online at wmv.aaccnet.org/ApprovedMethods/default.aspx, AACC International, St. Paul, MN

[5] Gessendorfer, B., Koehler, P., & Wieser, H. (2009) Anal. Bioanal. Chem. 395, 1721-1728. http://dx.doi.Org/10.1007/ S00216-009-3080-6

...

...

...

[7] Kahlenberg, F., Sanchez, D., Lachmann, I., Tuckova, L, Tlaskalova, H., Mendez, E., & Mothes, T. (2005) Eur. Food Res. Techno!. 13, 1189-1193

[8] Tye-Din, J., Stewart, J., Dromey, J., Beissbarth, T., van Heel.D., Tatham, A., Henderson, K., Mannering, S., Gianfrani, C., Jewell, D., Hill, A., McCluskey, J., Rossjohn, J., & Anderson, R. (2010) Sci. Transl. Med. 2,41-51. http://dx.doi.org/10.1126/scitranslmed.3001012

1) Vật liệu thử 4.1 và các thuốc thử 4.3, 4.5, 4.7, 4.8, 4.9, 4.11 có sẵn trong bộ sản phẩm RIDASCREEN® Gliadin competitive, R- Biopharm AG. Đây là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin đưa ra nhằm thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

2) Sản phẩm No. G-7765 của Sigma hoặc No. 22156 của Serva là các ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin đưa ra nhằm thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

4) Sản phẩm của RIDASCREEN ®. Đây là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin đưa ra nhằm thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 14235:2024

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH GLUTEN THỦY PHÂN TỪNG PHẦN TRONG SẢN PHẨM LÊN MEN CÓ NGUỒN GỐC TỪ NGŨ CỐC VÀ ĐẬU ĐỖ - PHƯƠNG PHÁP ELISA CẠNH TRANH R5

Foodstuffs - Determination of partially hydrolyzed gluten in fermented cereal-based and pulse-based products - R5 Competitive ELISA method

Lời nói đầu

TCVN 14235:2024 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2015.05 Partially hydrolyzed gluten in fermented cereal-based products. R5 Competitive ELISA;

TCVN 14235:2024 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F1 Ngũ cốc và đậu đỗ biên soạn, Viện Tiêu chuẩn Chất lượng Việt Nam đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH GLUTEN THỦY PHÂN TỪNG PHẦN TRONG SẢN PHẨM LÊN MEN CÓ NGUỒN GỐC TỪ NGŨ CỐC VÀ ĐẬU ĐỖ - PHƯƠNG PHÁP ELISA CẠNH TRANH R5

...

...

...

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định gluten thủy phân từng phần trong các sản phẩm thực phẩm lên men có nguồn gốc từ ngũ cốc và đậu đỗ.

Phương pháp này đã được xác nhận giá trị sử dụng trên các nền mẫu: bia, xyrô tinh bột, tinh bột, dịch chiết malt, bột nhào lên men và nước tương (xem Phụ lục A).

Tiêu chuẩn này không áp dụng để xác định gluten chưa thủy phân.

2  Tài liệu viện dẫn

Tiêu chuẩn này không sử dụng tài liệu viện dẫn.

3  Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên phản ứng miễn dịch enzym sử dụng kháng thể đơn dòng. Kháng thể này liên kết với trình tự axit amin ngắn QQPFP (glutamin-glutamin-prolin-phenylalanin-prolin) và với các trình tự liên quan, tồn tại dưới dạng motip trên tất cả các tiểu đơn vị prolamin ^[6]. Một số trình tự có khả năng kích thích miễn dịch celiac ^{[7], [8]}. Các hợp phần protein để xác định gluten từ thực phẩm được chiết bằng etanol. Sau khi ly tâm, phần nổi phía trên được sử dụng trong phép thử ELISA.

CHÚ THÍCH: Không quan sát thấy có phản ứng chéo đối với yến mạch, ngô, gạo, kê, teff, kiều mạch, quinoa hoặc hạt dền amranth.

...

...

...

4  Thuốc thử và vật liệu thử

Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích, nước sử dụng là nước cất hai lần hoặc nước có chất lượng tương đương.

Tất cả thuốc thử có thể bền được ít nhất 15 tháng khi bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

4.1  Khay vi thể (microtiter) (96 giếng), được tráng gliadin1).

4.2  Chất chuẩn

Lúa mì, lúa mạch đen và đại mạch được thủy phân riêng biệt bằng pepsin và trypsin, các hợp phần peptit được trộn lẫn (để chuẩn bị dung dịch chuẩn) và hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Dumas^[1],[5]. Chất chuẩn được bảo quản ở -20 °C ở dạng đông khô cho đến khi hoàn nguyên. Hoàn nguyên chất chuẩn trong dung dịch etanol 60 % (4.14) sao cho thu được nồng độ prolamin là 1 mg/ml. Các chất chuẩn pha sẵn trong bộ thử nghiệm ổn định trong tối thiểu 18 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8°C.

CHÚ THÍCH: Do bản chất của chất chuẩn, tất cả các kết quả chỉ có thể truy xuất liên kết chuẩn đến điểm mốc tương đối này. Không thể xác định độ đúng nếu sử dụng chất chuẩn không phải là chất chuẩn được chứng nhận. Do đó, độ chính xác của hệ thống thử nghiệm có thể bị sai lệch nhưng vẫn chấp nhận được.

4.3  Các dung dịch chuẩn, được chuẩn bị từ chất chuẩn (4.2), có các nồng độ gluten tương ứng 0, 20, 60, 180 và 540 ng/ml, đã pha sẵn để sử dụng, đựng trong chai có nắp đậy trong suốt, thể tích dung dịch là 1.3 ml ¹⁾.

4.4  Dung dịch chuẩn để bổ sung vào mẫu thử

...

...

...

Dung dịch bền trong 4 tuần khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

4.5  Chất cộng hợp, kháng thể peroxidase từ cải ngựa ký hiệu là R5; 0,7 ml, độ đậm đặc 11 lần, đựng trong chai màu đỏ có nắp ¹⁾.

4.6  Dung dịch cộng hợp

Hoàn nguyên chất cộng hợp (4.5) bằng cách pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:10 (ví dụ: 100 μl chất cộng hợp đậm đặc và 1 ml nước, đủ cho hai khay vi thể (4.1)). Trước khi lấy bằng pipet, lắc kỹ chai đựng dung dịch chất cô đặc cộng hợp. Cần đảm bảo nước sử dụng không bị nhiễm gliadin.

Dung dịch cộng hợp enzym đã pha loãng có độ ổn định hạn chế, do vậy chỉ hoàn nguyên lượng cần thiết cho phép phân tích tiếp theo trong ngày sử dụng.

4.7  Thuốc nhuộm đỏ (Red Chromogen Pro.), 10 ml, pha sẵn để sử dụng, đựng trong chai màu nâu có nắp ¹⁾.

4.8  Dung dịch dừng phản ứng, 14 ml, pha sẵn để sử dụng, đựng trong chai màu vàng có nắp¹⁾.

CẢNH BÁO: Dung dịch dừng phản ứng có chứa axit sulfuric 0,5 M. Không để dung dịch này tiếp xúc với da và mắt.

4.9  Dịch pha loãng mẫu đậm đặc, 60 ml, độ đậm đặc 5 lần, đựng trong chai màu trắng có nắp¹⁾.

...

...

...

Pha loãng một lượng nhất định dịch pha loãng mẫu đậm đặc (4.9) bằng nước (ví dụ: 3 ml dịch pha loãng mẫu đậm đặc và 12 ml nước, đủ để pha loãng 10 mẫu). Dịch pha loãng mẫu này bền trong 1 ngày, cần đảm bảo rằng dịch pha loãng mẫu không bị nhiễm gliadin.

4.11  Chất đệm rửa, 100 ml, dạng cô đặc gấp 10 lần, đựng trong chai màu nâu có nắp ¹⁾.

4.12  Dung dịch đệm rửa

Pha loãng một lượng nhất định chất đệm rửa (4.11) bằng nước (ví dụ: 100 ml chất đệm rửa và 900 ml nước). Nếu chất đệm rửa có chứa tinh thể thì hòa tan các tinh thể bằng cách đun vật chứa trong nồi cách thủy ở 37 °C.

Dung dịch đệm rửa này bền trong 4 tuần khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

4.13  Etanol, 99 %.

4.14  Etanol 60 %

Cho 150 ml etanol (4.13) vào 100 ml nước cất và lắc đều.

4.15  Gelatin cá 2).

...

...

...

Cho 30 ml nước vào xyranh chia vạch 100 ml, thêm 10 g gelatin cá (4.15) và trộn kỹ, thêm 60 ml etanol (4.13), trộn và chỉnh pH đến 8,5 nếu cần. Thêm nước đến 100 ml.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và thiết bị, dụng cụ cụ thể như sau:

5.1  Máy xay/máy nghiền, cối và chày phòng thử nghiệm.

5.2  Máy quay hoặc máy lắc.

5.3  Máy ly tâm.

5.4  Bộ đọc khay vi thể.

5.5  Micropipet, có thể phân phối các thể tích từ 20 μl đến 200 μl và 200 μl đến 1000 μl.

5.6  Pipet chia vạch.

...

...

...

5.8  Lọ thủy tinh ly tâm, có nắp vặn.

5.9  Máy trộn Vortex.

5.10  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 mg.

5.11  Máy đo quang phổ, có thể đo ở bước sóng 450 nm.

6  Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 9027 (ISO 24333)^[2].

Mẫu phòng thử nghiệm nhận được phải đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Bảo quản mẫu trong phòng khô, lạnh, tránh ánh sáng.

7  Chuẩn bị mẫu thử

...

...

...

a) Tiến hành chuẩn bị mẫu trong phòng cách ly với quy trình ELISA (xem 8.2); nếu chỉ có một phòng, cần xem xét độ nhạy cao của phép thử vả kiểm tra mức độ ô nhiễm.

b) Bụi ngũ cốc trong không khí và thiết bị phòng thử nghiệm đã qua sử dụng có thể làm ô nhiễm gliadin trong phép thử. Do đó, cần đeo găng tay trước khi bắt đầu thử nghiệm và trong quá trình thử nghiệm.

c) Làm sạch các bề mặt tiếp xúc, lọ thủy tinh, máy xay và các thiết bị khác bằng etanol 60 % (4.14), trước khi sử dụng cho mẫu tiếp theo.

d) Kiểm tra ô nhiễm gliadin của thuốc thử và thiết bị bằng que thử, nếu cần.

e) Mẫu dạng rắn có thể không đồng nhất; do đó, nghiền thật kỹ phần mẫu đại diện và đồng nhất trước khi cân.

7.2  Đồng hóa phần mẫu thử

7.2.1  Mẫu dạng rắn (ví dụ: tinh bột)

Cân 1 g phần mẫu thử, đồng hóa bằng máy lắc (5.2) và thêm 10 ml dung dịch etanol 60 % (4.14).

7.2.2  Mẫu dạng lỏng (ví dụ: xyrô tinh bột)

...

...

...

7.2.3  Mẫu bia

Dùng pipet chia vạch (5.6), lấy 1 ml phần mẫu thử, thêm 9 ml dung dịch etanol 60 % có chứa gelatin cá (4.16) và trộn. Khuấy huyền phù trước và trong khi sử dụng.

7.2.4  Mẫu malt và hoa hublong

Cân 1 g phần mẫu thử, thêm 10 ml dung dịch etanol 60 % có chứa gelatin cá (4.16) và trộn. Khuấy huyền phù trước và trong khi sử dụng.

7.3  Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Trộn kỹ phần mẫu thử [đã đồng hóa (xem 7.2), nếu cần] trong ít nhất 30 s bằng máy trộn Vortex (5.9) và lắc kỹ bằng cách đặt ngược vật chứa trên máy lắc (5.4) hoặc dùng máy quay (5.4) trong 10 min. Ly tâm phần mẫu thử với gia tốc ít nhất là 2500 g, ở nhiệt độ phòng (từ 20 °C đến 25 °C) trong 10 min. Tách riêng phần nổi phía trên, pha loãng 50 lần bằng dịch pha loãng mẫu (4.10), ví dụ: trộn 20 μl phần nổi phía trên sau khi ly tâm với 980 μl dịch pha loãng mẫu.

Phần nổi phía trên thu được sau khi ly tâm có thể bền trong bốn tuần khi được bảo quản trong lọ đậy kín, để nơi tối ở nhiệt độ phòng.

Sử dụng 50 μl dung dịch mẫu thử cho mỗi giếng trong phép thử (xem 8.2).

8  Cách tiến hành

...

...

...

a) Phép thử này chỉ được thực hiện bởi nhân viên phòng thử nghiệm được đào tạo. Phải tuân thủ nghiêm ngặt hướng dẫn sử dụng. Không tráo đổi thuốc thử riêng lẻ giữa các bộ thử nghiệm có số lô khác nhau.

b) Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. Chất sinh màu đỏ nhạy với ánh sáng do đó tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng.

c) Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C ngay sau khi sử dụng. Các vi giếng chưa sử dụng phải được đưa trở lại túi giấy bạc ban đầu. Làm kín miệng túi, giữ lại chất hút ẩm có sẵn bên trong túi.

d) Không để các vi giếng bị khô giữa các bước thao tác.

e) Độ tái lập trong phép thử ELISA phụ thuộc nhiều vào độ nhất quán khi rửa các vi giếng, cẩn thận làm theo trình tự rửa nêu trong quy trình của phép thử ELISA.

f) Để tránh ánh nắng trực tiếp trong suốt quá trình ủ, nên che kín các khay vi thể.

g) Phản ứng của chất sinh màu đỏ cần được thực hiện nơi tối.

h) Phân tích lặp lại hai lần đối với từng dung dịch chuẩn và từng phần mẫu thử.

i) Sử dụng mẫu không chứa gluten và mẫu bổ sung gluten làm mẫu kiểm soát phép thử.

...

...

...

a) Chèn đủ số lượng giếng vào giá đỡ vi giếng để tất cả các chất chuẩn và mẫu thử được phân tích lặp lại hai lần. Ghi lại các vị trí của chất chuẩn và mẫu thử.

b) Dùng micropipet (5.5) thêm 50 μl mỗi dung dịch chuẩn (4.3) hoặc các dung dịch mẫu thử đã chuẩn bị (7.3), để tách riêng các giếng trong hai lần lặp lại.

c) Thêm 50 μl dung dịch cộng hợp (4.6), trộn nhẹ bằng cách lắc giếng bằng tay và ủ trong 30 min ở nhiệt độ phòng.

d) Đổ chất lỏng ra khỏi giếng và gõ mạnh giá đỡ vi giếng lộn ngược (ba lần trong một hàng) vào giấy thấm để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn chất lỏng khỏi giếng. Đổ đầy tất cả các giếng với 250 μl dung dịch đệm rửa (4.12) và đổ chất lỏng ra. Lặp lại thêm hai lần.

e) Thêm 100 μl thuốc nhuộm đỏ (4.7) vào mỗi giếng. Trộn nhẹ bằng cách lắc giếng bằng tay và ủ trong 10 min ở nhiệt độ phòng, nơi tối.

f) Thêm 100 μl dung dịch dừng phản ứng (4.8) vào mỗi giếng. Trộn nhẹ bằng cách lắc giếng bằng tay và đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm so với mẫu trắng. Đọc số đo độ hấp thụ trong vòng 10 min sau khi thêm dung dịch dừng phản ứng.

8.3  Tiêu chí xác định đường chuẩn

Hình dạng của đường chuẩn được thể hiện trong giấy chứng nhận đảm bảo chất lượng kèm theo bộ thử nghiệm. Độ hấp thụ có thể khác nhau giữa các lần chạy khác nhau (ví dụ: do nhiệt độ hoặc nhà phân tích khác nhau). Tuy nhiên, hình dạng của đường chuẩn phải giống với hình dạng được đưa ra trong giấy chứng nhận đảm bảo chất lượng.

Yêu cầu tối thiểu như sau:

...

...

...

- Giá trị OD của chất chuẩn phải liên tục giảm với nồng độ gluten cao hơn, đặc biệt khi so sánh dung dịch chuẩn 1 (0 ng/ml) và dung dịch chuẩn 2 (20 ng/ml).

Giá trị OD với dung dịch chuẩn 1 cao hơn nhiều so với giá trị OD được nêu trong giấy chứng nhận có thể là dấu hiệu của lỗi trong quá trình dùng pipet hút các dịch lỏng hoặc do quá trình ủ.

9  Tính và biểu thị kết quả

Tính kết quả bằng cách sử dụng hàm chốt trục bậc ba (cubic sμline function). Không sử dụng phép ngoại suy. Nồng độ prolamin trong dịch chiết mẫu được đọc từ đường chuẩn và được tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml).

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng phần mềm RIDA^®SOFT Win (No. 29999) 4).

Phương pháp nêu trong tiêu chuẩn này sử dụng chất chuẩn là hỗn hợp thủy phân prolamin từ lúa mì, lúa mạch đen và đại mạch (xem 4.2), do đó nồng độ prolamln trong dịch chiết mẫu được chuyển đổi thành nồng độ gluten theo hệ số chuyển đổi bằng 2.

a) Đối với mẫu dạng rắn

Hàm lượng gluten trong mẫu thử, X, biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo Công thức (1):

...

...

...

Trong đó:

c

là nồng độ gluten trong dịch chiết mẫu, tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml);

500

là hệ số pha loãng, bằng thể tích dung dịch mẫu thử thu được trên khối lượng phần mẫu thử (xem Điều 7), tính bằng mililit trên gam (ml/g);

1000

là hệ số chuyển đổi từ gam sang kilogam.

b) Đối với mẫu dạng lỏng

Hàm lượng gluten trong mẫu thử, X, biểu thị bằng miligam trên lít (mg/L), được tính theo Công thức (2):

...

...

...

(2)

Trong đó:

c

là nồng độ gluten trong dịch chiết mẫu, tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml);

500

là hệ số pha loãng, bằng thể tích dung dịch mẫu thử thu được trên thể tích phần mẫu thử (xem Điều 7);

1000

là hệ số chuyển đổi từ mililit sang lít.

Ngoài ra, có thể sử dụng đường cong đa thức bậc hai.

...

...

...

Các giá trị độ chụm dưới đây được xác định từ dữ liệu phân tích liên phòng thử nghiệm nêu trong Phụ lục A. Các giá trị độ chụm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với dải nồng độ và nền mẫu đã sử dụng.

10.1  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong cùng một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r = 2,77 s_r, giá trị s_r được nêu trong Bảng A.1 của Phụ lục A.

10.2  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giá trị giới hạn tái lập R = 2,77 s_R, giá trị s_R được nêu trong Bảng A.1 của Phụ lục A.

11  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:

- mọi thông tin cần thiết cho việc nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;

...

...

...

- ngày nhận mẫu của phòng thử nghiệm;

- ngày thử nghiệm;

- mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi sự cố bất thường có thể ảnh hưởng đến các kết quả.

Phụ lục A

(tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Dữ liệu độ chụm nêu trong Bảng A.1 thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm thực hiện năm 2011 do 16 phòng thử nghiệm tham gia, tiến hành trên 7 mẫu thử theo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này. Kết quả chi tiết về nồng độ gluten xác định bởi toàn bộ 16 phòng thử nghiệm được nêu trong Bảng A.2 và nồng độ gluten xác định bởi 13 phòng thử nghiệm sau khi loại trừ các phòng thử nghiệm E, F, K được nêu trong Bảng A.3.

Bảng A.1 - Dữ liệu thống kê về độ chụm

...

...

...

Mã số mẫu

1

2

3

4

5

6

7

Tổng số phòng thử nghiệm sau khi trừ ngoại lệ

...

...

...

12

11

13

13

13

13

Tổng số lần lặp lại

26

24

...

...

...

26

26

26

26

Giá trị trung bình của tất cả dữ liệu, mg/kg

2,36

26,2

119,5

1,29

...

...

...

48,4

145,6

Độ lệch chuẩn lặp lại, s_r, mg/kg

2,31

7,92

37,2

2,03

1,73

11,2

...

...

...

Độ lệch chuẩn tái lập, s_R, mg/kg

2,98

9,67

37,2

3,05

3,65

12,5

40,0

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSD_r, %

...

...

...

30,2

31,2

157,3

16,3

23,1

19,5

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSD_R, %

126,1

36,8

...

...

...

236,1

34,4

25,9

27,5

Độ thu hồi, %

Không áp dụng

87

119

Không áp dụng

...

...

...

69

97

CHÚ DẪN

Các mẫu thử bao gồm:

1 Mẫu bia không chứa gluten;

2 Mẫu bia bổ sung gluten, 30 mg/kg;

3 Mẫu bia bổ sung gluten, 100 mg/kg;

4 Mẫu xyrô tinh bột không chứa gluten;

5 Mẫu xyrô tinh bột lúa mì chứa gluten tự nhiên;

...

...

...

7 Mẫu bột nhào lên men có chứa gluten, 150 mg/kg.

Bảng A.2 - Nồng độ gluten được xác định theo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này bởi tất cả các phòng thử nghiệm tham gia (dữ liệu thô)

Phòng thử nghiệm

Nồng độ gluten, mg/ kg ^a

1 ^b

2

3

4

5

...

...

...

7

Lần lặp lại

1

2

1

2

1

2

1

...

...

...

1

2

1

2

1

2

A

2,13

5,80

...

...

...

20,5

111,6

93,9

4,47

7,73

7,60

8,62

46,7

47,2

...

...

...

170,0

B

1,46

2,66

40,8

13,8

151,4

127,4

2,98

...

...

...

10,6

5,10

38,8

53,0

163,6

122,8

C

5,30

10,6

...

...

...

82,2

192,2

107,6

6,12

1,90

12,8

12,6

47,2

67,4

...

...

...

143,4

D

0,74

1,77

23,8

28,6

175,2

97,6

-3,35

...

...

...

9,80

11,0

33,0

60,2

106,4

107,6

E

6,45

20,4

...

...

...

50,4

24,6

204,0

23,5

17,6

20,4

29,4

68,6

72,8

...

...

...

244,2

F

-5,46

-3,99

14,6

27,0

124,0

160,0

-5,15

...

...

...

9h20

6,80

47,0

51,4

128,8

151,6

G

6,06

4h30

...

...

...

32,0

216,2

208,2

3,29

-2,34

15,0

14,0

46,8

85,4

...

...

...

203,0

H

7,02

1,56

44,4

26,2

145,6

32,8

5,79

...

...

...

20,5

16,1

38,8

31,0

94,6

88,9

I

-0,65

-1,33

...

...

...

13,8

101,2

64,4

-0,89

-0,62

5,44

4,22

35,8

45,0

...

...

...

75,0

J

-1,50

1,14

21,2

20,0

121,8

128,8

-0,73

...

...

...

7,40

8,00

45,6

58,3

132,9

139,2

K

16,3

14,8

...

...

...

44,8

216,7

308,6

21,1

9,70

33,5

22,4

87,5

80,0

...

...

...

30,2

L

1,69

-0,33

39,8

49,0

224,8

228,8

-1,83

...

...

...

13,2

11,6

64,0

67,2

171,6

244,6

M

-0,66

4,13

...

...

...

19,3

129,4

133,6

-2,27

-0,62

10,0

8,60

36,1

39,6

...

...

...

120,4

N

0,04

0,76

34,2

18,4

97,0

108,6

1,84

...

...

...

10,8

9h20

43,4

44,6

117,6

154,4

O

1,57

0,41

...

...

...

16,5

110,7

136,6

-0,11

1,26

11,7

8h20

51,3

46,3

...

...

...

164,6

P

5,96

0,84

25,4

24,8

149,4

111,2

1,54

...

...

...

12,6

10,8

38,2

46,2

194,8

111,2

^a Việc tính nồng độ của các mẫu chứa gluten (mẫu 2, 3, 5, 6 và 7) được thực hiện trên cơ sở hàm chốt trục bậc ba bằng phần mềm RIDA^® SOFT Win; số liệu thống kê của mẫu 1 và mẫu 4 không chứa gluten được tính trên cơ sở hàm đa thức bậc hai; các giá trị cho các mẫu mù được đưa ra dưới dạng lặp lại 1 hoặc lặp lại 2.

^b Mẫu 1, bia không chứa gluten; mẫu 2, bia bổ sung gluten 30 mg/kg; mẫu 3, bia bổ sung gluten 100 mg/kg; mẫu 4, xyrô tinh bột không chứa gluten; mẫu 5, xyrô tinh bột lúa mì chứa gluten tự nhiên; mẫu 6, bột nhào lên men có chứa gluten, 70 mg/kg; mẫu 7, bột nhào lên men cố chứa gluten, 150 mg/kg.

Bảng A.3 - Nồng độ gluten được xác định theo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này sau khi trừ ngoại lệ các phòng thử nghiệm E, F, K

...

...

...

Phòng thử nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

Lần lặp lại

...

...

...

2

1

2

1

2

1

2

1

2

...

...

...

2

1

2

A

2,13

5,80

23,6

20,5

111,6

...

...

...

4,47

7,73

7,6

8,62

46,7

47,2

153,0

170,0

B

...

...

...

2,66

40,8

13,8

151,4

127,4

2,98

2,13

10,6

5,1

...

...

...

53,0

163,6

122,8

C

5,30

10,6

34,2^c

82,2^c

192,2

...

...

...

6,12

1,90

12,8

12,6

47,2

67,4

181,4

143,4

D

...

...

...

1,77

23,8

28,6

175,2

97,6

-3,35

-3,41

9,8

11,0

...

...

...

60,2

106,4

107,6

G

6,06

4,30

32,4

32,0

216,2^d

...

...

...

3,29

-2,34

15,0

14,0

46,8

85,4

192,8

203,0

H

...

...

...

1,56

44,4

26,2

145,6

32,8

5,79

3,17

20,5

16,1

...

...

...

31,1

94,6

88,9

I

-0,65

-1,33

22,2

13,8

101,2

...

...

...

-0,89

-0,62

5,4

4,2

35,8

45,0

118,4

75,0

J

...

...

...

1,14

21,2

20,0

121,8

128,8

-0,73

-1,63

7,4

8,0

...

...

...

58,3

132,9

139,2

L

1,69

-0,33

39,8

49,0

224,8^d

...

...

...

-1,83

3,39

13,2

11,6

64,0

67,2

171,6

244,6

M

...

...

...

4,13

19,9

19,3

129,4

133,6

-2,27

-0,62

10,0

8,6

...

...

...

39,6

161,7

120,4

N

0,04

0,76

34,2

18,4

97,0

...

...

...

1,84

4,41

10,8

9,2

43,4

44,6

117,6

154,4

O

...

...

...

0,41

19,1

16,5

110,7

136,6

-0,11

1,26

11,7

8,2

...

...

...

46,3

152,8

164,6

P

5,96

0,84

25,4

24,8

149,4

...

...

...

1,54

1,33

12,6

10,8

38,2

46,2

194,8

111,2

^a Việc tính nồng độ của các mẫu chứa gluten (mẫu 2, 3, 5, 6 và 7) được thực hiện trên cơ sở hàm chốt trục bậc ba bằng phần mềm RIDA^® SOFT Win; số liệu thống kê của mẫu 1 và mẫu 4 không chứa gluten được tính trên cơ sở hàm đa thức bậc hai; các giá trị cho các mẫu mù được đưa ra dưới dạng lặp lại 1 hoặc lặp lại 2.

...

...

...

^c Trung bình ngoại lệ theo phép thử Cochran.

^d Trung bình ngoại lệ theo phép thử Grubb lặp lại.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 8133-2 (ISO/TS 16634-2), Sản phẩm thực phẩm - Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng cách đốt cháy theo nguyên tắc Dumas và tính hàm lượng protein thô - Phần 2: Ngũ cốc, đậu đỗ và sản phẩm ngũ cốc nghiền

[2] TCVN 9027 (ISO 24333), Ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc - Lấy mẫu

[3] TCVN 12438:2018 (CODEX STAN 118-1981 with Amendment 2015), Thực phẩm cho chế độ ăn đặc biệt dùng cho người không dung nạp gluten

[4] AACC International, Method 38-50.01, Immunochemical Determination of Gluten in Corn Flour and Corn-Based Products b;y Sandwich ELISA, Approved Methods of Analysis, 11th Ed., published online at wmv.aaccnet.org/ApprovedMethods/default.aspx, AACC International, St. Paul, MN

[5] Gessendorfer, B., Koehler, P., & Wieser, H. (2009) Anal. Bioanal. Chem. 395, 1721-1728. http://dx.doi.Org/10.1007/ S00216-009-3080-6

...

...

...

[7] Kahlenberg, F., Sanchez, D., Lachmann, I., Tuckova, L, Tlaskalova, H., Mendez, E., & Mothes, T. (2005) Eur. Food Res. Techno!. 13, 1189-1193

[8] Tye-Din, J., Stewart, J., Dromey, J., Beissbarth, T., van Heel.D., Tatham, A., Henderson, K., Mannering, S., Gianfrani, C., Jewell, D., Hill, A., McCluskey, J., Rossjohn, J., & Anderson, R. (2010) Sci. Transl. Med. 2,41-51. http://dx.doi.org/10.1126/scitranslmed.3001012

1) Vật liệu thử 4.1 và các thuốc thử 4.3, 4.5, 4.7, 4.8, 4.9, 4.11 có sẵn trong bộ sản phẩm RIDASCREEN® Gliadin competitive, R- Biopharm AG. Đây là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin đưa ra nhằm thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

2) Sản phẩm No. G-7765 của Sigma hoặc No. 22156 của Serva là các ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin đưa ra nhằm thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.

4) Sản phẩm của RIDASCREEN ®. Đây là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin đưa ra nhằm thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.